Lateral Flow Assay Udviklingsvejledning

Lateral Flow Assay er en anordning, der bruges til hurtig testning derhjemme og også til klinisk testning. De er de mest pålidelige og præcise anordninger, der bruges i næsten alle udviklede og udviklingslande. Derudover indeholder udviklingsvejledningen til lateral flow assay næsten 10 trin, der bestemmer udviklingsprocessen for et lateral flow assay. Normalt har lateral flow assays en prøvepude, en konjugatpude, en nitrocellulosemembran, en adsorbentpude og en buffer. Der kan dog være nogle ændringer i etiketterne, da der er forskellige etiketter, der bruges i lateral flow assays.

For at starte udviklingsvejledningen til lateral flow-analysen er det vigtigt at overveje et par handlinger, før processen starter. Først og fremmest er det vigtigt at analysere det format, der skal vælges til lateral flow-analysen, om det skal være et konkurrencepræget eller sandwich-format. Grundlæggende set afhænger udviklingsvejledningen til lateral flow-analysen af ​​analysens udviklingsproces. Det første kritiske og vigtigste trin er at identificere den kontrolanalyse, der vil hjælpe med at identificere målanalytten i prøven. Denne udviklingsvejledning vil give en generel LFA-udviklingsproces, da forskellige analyser også har en forskellig proces.

Det første trin i udviklingsvejledningen er udvælgelsen af ​​nanopartikler. Udvælgelsen af ​​nanopartikler varierer i størrelse og form. Der findes forskellige størrelser til lateral flow-analyser. Der findes også 40 nm guldnanopartikler med enten kulstof- eller citratoerflader, som yderligere kan anvendes til adsorptionsprocessen af ​​proteiner. Andre nanopartikler, der kan vælges til udvikling af LFA, omfatter carboxylguld, carboxylguld-nanoskaller osv. Derudover findes der andre prober såsom celluloseperler, farvet polystyren og fluorescerende prober. Fordelen ved udvælgelsen af ​​carboxylguld-nanopartikler er, at der kræves meget færre antistoffer til adsorptionsprocessen, og på grund af disse nanopartikler dannes en binding, der er en stabil og irreversibel amidbinding. Det skal dog huskes, at de resulterende kræfter, der findes mellem nanopartiklerne og antistofferne, skyldes deres koblingsmiljø.

Det andet trin er valg af antistof. Antistofvalg er et kritisk trin, da LFA'ernes ydeevne afhænger af antistoffernes affinitet, kinetik og andre steriske egenskaber. Bindningen af ​​antistoffer er også vigtig for påvisning af resultaterne. En anden vigtig faktor ved valg af antistoffer er de to typer af dem. De to typer antistoffer er monoklonale og polyklonale. Monoklonale antistoffer er lette at fremstille, mens polyklonale antistoffer har relativt høj følsomhed sammenlignet med monoklonale. I trinnet i antistofudvælgelsesprocessen er der yderligere to trin, dvs. rensning af antistof og kontrollinje -antistof. I antistofudvalget er den foreslåede stamme at screene antistofferne af den grund, at de skal testes på forhånd. Antistofferne kan screenes og testes ved at opbygge en meget foreløbig og indledende version af det laterale flowassay, der kan fungere som en testprøveindretning. Antistoffernes ydeevne er forskellig i en anden slags LFA'er. For eksempel er kinetikken i ELISA ikke af stor betydning. Og når vi taler om det laterale flowassay, er der visse betingelser, som antistoffer skal være i stand til at udføre. Først og fremmest bør antistofferne være aktive, selv efter at de er blevet konjugeret med nanopartiklerne, og deres strukturelle integritet bør ikke blive skadet på nogen måde. De skal også have evnen til øjeblikkeligt at give deres reaktion, når prøven rehydratiseres igen af ​​prøven. Inkubationstiden i andre former for assays er længere i forhold til Lateral Flow Assay, hvor bindingen til testlinjen skal udføres inden for et tidsrum på få sekunder.

Den tredje proces i denne proces er en nitrocellulosemembran, og den er en meget vigtig del af LFA, da den har test- og kontrollinjer. Nitrocellulosemembranen har også de reagenser, der arbejder for at producere resultaterne. Den fås i forskellige størrelser, porøsiteter og designs. Faktisk er nitrocellulosemembranen afhængig af kapillærstrømningstiden. Ved kapillær strømningstid betyder det, at den tid, det tager for prøven at flyde op til 4 cm. I dette trin er der et andet trin, der kaldes membranstripping. Bufferen, hvori et specifikt protein er stribet, kan have en betydelig indvirkning på de endelige resultater af ethvert lateralt flowassay. Selvom mange proteiner kan opløses i 1x PBS, er nogle ekstremt følsomme over for pH, saltkoncentration og forekomsten af ​​en stabilisator, som trehalose kan navngives til. Membranstripping er et andet vigtigt trin, der følger med dette trin. I dette trin er udformningen af ​​den laterale strømningsassaytest at stribe testen og kontrollere antistoflinjerne, der er til stede på nitrocellulosemembranen. En vigtig overvejelse i dette trin er nitrocellulosemembran, hvor det siges ikke at holde nitrocellulosemembranen på et sted, hvor der ikke er fugt, snarere er det hele tørret. For udviklingen af ​​det laterale flowassay skal temperaturen for nitrocellulosemembranen være fugtig. Da der er forskellige formater af assays, dvs. konkurrencedygtigt format og sandwichformat, som også er meget vigtige. Antistofkoncentrationen er forskellig i begge formater for sandwichformatet. Den anbefalede antistofkoncentration er 1 mg/ml for kun test- og kontrollinje -antistoffer, og denne grænse kan variere op til 0.5 til 2 mg/ml. I nitrocellulosemembrantrinnet og guide til udvikling af lateral strømning er et andet trin inkluderet membranblokerende trin. At udføre dette trin har mange fordele, såsom den forbedrede strømning af væsken, teststrimlernes stabilitet og blokering af den ikke-specifikke binding giver således de sande resultater. For det meste af nitrocellulosemembranen i det laterale flowassay er der en proprietær løsning, der tilsættes til at gøre membranerne hydrofile.

Det næste trin er konjugeret og konjugeret pude. For at udvikle et lateralt flow assay er det vigtigt at udvikle optimering af konjugerende parametre. Når et konjugat fremstilles til det laterale flowassay, afgives det og tørres på en konjugatpude. Til udvikling af en stabiliseret konjugering af antistoffer kan der være flere trin. De trin, der er involveret i udviklingen af ​​en sammenhængende og forbedret effekt af konjugeringen. I dette trin er konjugeringsstabilitet et meget vigtigt trin, og derfor skal kolloid stabilitet optimeres, mens LFA designes. den kolloidale stabilitet er meget afgørende for det laterale flowassay, og derfor holdes dette altid under hensyntagen til design og optimering af LFA. Guldnanopartiklerne, der spiller en afgørende rolle i konjugeringen i LFA, har meget unikke optiske egenskaber ved hjælp af hvilke de absorberer og spreder lyset med nøjagtighed og effektivitet. Den stærke vekselvirkning mellem nanopartikler og lys sker på grund af ledningselektronerne, der er til stede på metaloverfladen, hvilket resulterer i den kollektive svingning, når elektronerne bliver begejstrede af lyset med samme og samme frekvens. Efter der er en vellykket konjugering er der nogle effekter på de optiske egenskaber, da ændringen observeres i brydningsindekset, som yderligere kan spores i spektrene af UV-vis ved sondringen af ​​den røde linje. Også til behandling af konjugeringspuden kan der være forskellige metoder. Nogle af dem er nedsænkning eller sprøjtning ensartet ved hjælp af en automatiseret dispenser.

Derefter finder udvælgelsesprocessen for prøvepuden sted. Dette er den første del af lateral flow -analysen, derfor er det vigtigt at kontrollere prøvepudens materiale og forbehandlingen af ​​prøvepuden for dets flow og effektivitet. De prøvepuder, der anvendes til lateral flow-analyser, er af forskellige typer, såsom fibre, bomuld, syntetiske materialer osv. Det er også blevet observeret, at nogle af prøverne, såsom urin, blod osv., kan variere på grund af mange andre faktorer, herunder biologiske faktorer, spisetidspunkt, drikkevarer indtaget før prøven opsamles på lateral flow-analyseenheden og mange andre. Til behandling af prøvepuden og optimering af den kan den optimerede buffer anvendes, hvilket også har mange fordele. Under udviklingen af ​​lateral flow-analysen og valget af prøvepuden kan den optimerede buffer bidrage til at forbedre analysens ydeevne ved at reducere prøvens variation, herunder protein, pH, viskositet, saltkoncentration osv. Det kan også forbedre analysens flow og konsistens, mens den udvikles. Behandlingsbuffere har vist sig at være yderst nyttige til at opretholde flow og konsistens, normalisere pH-værdien og fungere som blokeringsmidler ved at sammensmelte proteiner, salte og overfladeaktive stoffer med den passende koncentration af hver. Den vigtigste specifikation for prøvepuden, der skal kontrolleres, er absorptionskapaciteten, da den fortæller om prøvevolumenet til en test.

Når prøvepuden er valgt, kommer valget af vægeunderlag derefter. Den transporterende pude hjælper med adsorptionsprocessen af ​​reagenserne, som ikke blev optaget af hver linje, dvs. testlinje og kontrollinjer. Den transporterende pude stopper også den tilbagestående strøm af væsken, der bruges som en prøve. Det foreslås, at materialet skal kontrolleres for at gemme enheden fra eventuelle uoverensstemmelser, der kan føre til problemer og måske falske resultater, mens materialet vælges til vægeunderlaget. Bortset fra det normale er det tykke materiale eller den transporterende pude ikke bedre end det tyndere materiale. Det tyndere materiale er bedre til at yde bedre og har som regel materiale med højere kapacitet nogle gange. Men hvert materiale skal kontrolleres for dets egenskaber og dets egnethed til udviklingen af ​​det laterale flowassay. For at vælge størrelsen og materialet på den transporterende pude er det nødvendigt at holde den i overensstemmelse med den faktor, at absorptionskapaciteten skal være højere og buffervolumen skal køre.

I det laterale flowassay er strimletestsamlingen også trin i dets udviklingsguide. I stribetestsamling samles LFA'erne baseret på stor fremstilling eller fremstilling i mindre skala. For nogle typer laterale flowassays er den kvantitative udlæsning muligvis ikke kravet, men målepindformat ville være påkrævet for at køre strimletestsamlingen i LFA. Der er en kassette, der har en strimletest indeni, er et af de mest essentielle og afgørende trin for at opnå assayet, som er reproducerbart og også pålideligt. De to tidligere nævnte specifikationer er særdeles vigtige for de kvantitative tests, især. Kassettens hovedarbejde er at tilvejebringe det nødvendige tryk til væsken. Dette er for at sikre, at der er den optimale strømning, og at væsken også passerer gennem samlingen ved den samme strømning. Kassetten sørger også for, at væsken ikke forbliver resultater på kanterne og bare flyder på puderne.

Efter strimletestsamlingen kører det næste trin analysen. Der er forskellige teknikker til at køre assayet, såsom distriktsassay i væskekonjugatet, fulde assays for tørret konjugat og løbebufferen. Til analyse af strimlen skal det være kendt, om testen er kvalitativ eller kvantitativ, og den rigtige analysemetode skal vælges. For at analysere assayet kan det enten gøres med det blotte øje, hvor der ville være ja/nej -resultater eller ved at fange et indtryk af testlinjen, en flatbed -scanner eller et kamera med kontrolleret belysning kan bruges. Det sidste trin er optimering af assayet, hvor valg af det rigtige antistofpar, nitrocellulosemembran, vægeunderlag, adsorberende pude og alle andre dele er inkluderet.

konklusion:

Udviklingsvejledningen til Lateral Flow Assay består af ni til ti trin, som skal følges nøje for at oprette et lateralt flow-assay.

Referencer

https://cdn.shopify.com/s/files/1/0257/8237/files/BioReady_Lateral_Flow_Handbook.pdf