Guía de desenvolvemento de ensaios de fluxo lateral
Fluxo lateral ensaio é o dispositivo que se usa para probas rápidas na casa e tamén para probas clínicas. Son os dispositivos máis fiables e precisos que se utilizan en case todos os países desenvolvidos e en desenvolvemento. Ademais, o fluxo lateral Ensaio Guía de desenvolvemento ten case 10 pasos para determinar o proceso de desenvolvemento dun ensaio de fluxo lateral. Normalmente, Ensaios de fluxo lateral ten unha almofada de mostra, almofada conxugada, membrana de nitrocelulosa, etiqueta unha almofada adsorbente e un tampón. Non obstante, podería haber algúns cambios nas etiquetas xa que hai diferentes etiquetas que se usan nos ensaios de fluxo lateral.
Para comezar o guía de desenvolvemento do ensaio de fluxo lateral, é importante considerar poucas accións antes de iniciar o proceso. Primeiro de todo, é importante analizar o formato a escoller para o ensaio de fluxo lateral se sería competitivo ou en formato sándwich. Basicamente, a guía de desenvolvemento do ensaio de fluxo lateral depende do proceso de desenvolvemento do ensaio. O primeiro paso crítico e máis importante é identificar o ensaio de control que axudará a identificar o analito obxectivo na mostra. Esta guía de desenvolvemento dará un proceso xeral de desenvolvemento de LFA porque os diferentes ensaios tamén teñen un proceso diferente.
O primeiro paso para o guía de desenvolvemento é a selección de nanopartículas. A selección de nanopartículas varía en tamaño e forma. Hai diferentes tamaños dispoñibles para os ensaios de fluxo lateral. Tamén chegan as nanopartículas de ouro de 40 nm con superficie de carbono ou citrato que se poden empregar para o proceso de adsorción das proteínas. As outras nanopartículas que se poden seleccionar para o desenvolvemento de LFA inclúen ouro carboxilo, nanocascas de ouro carboxilo, etc., ademais de que hai outras sondas como contas de celulosa, poliestireno tinguido e sondas fluorescentes. O punto positivo da selección das nanopartículas de ouro carboxilo é que para o proceso de adsorción se requiren moi menos anticorpos e debido a estas nanopartículas fórmase un enlace que é un enlace amida estable e irreversible. Non obstante, hai que ter en conta que as forzas resultantes que se atopan entre as nanopartículas e os anticorpos débense ao seu entorno de acoplamento.
O segundo paso é a selección de anticorpos. A selección de anticorpos é un paso crítico xa que o rendemento dos LFA depende da afinidade dos anticorpos, a cinética e outras propiedades estéricas. Ademais, a unión de anticorpos é importante para a detección dos resultados. Outro factor importante ao seleccionar os anticorpos son os dous tipos deles. Os dous tipos de anticorpos son monoclonais e policlonais. Os anticorpos monoclonais son fáciles de fabricar mentres que os anticorpos policlonais teñen unha sensibilidade relativamente alta en comparación cos monoclonais. Na etapa do proceso de selección de anticorpos, hai outros dous pasos, é dicir, a purificación de anticorpos e a liña de control de anticorpos. Na selección de anticorpos, o talo suxerido é examinar os anticorpos polo motivo de que deberían ser probados previamente. Os anticorpos pódense examinar e probar construíndo unha versión inicial e preliminar do ensaio de fluxo lateral que poida funcionar como un dispositivo de mostra de proba. O rendemento dos anticorpos é diferente nun tipo diferente de LFA. Por exemplo, en ELISA a cinética non ten moita importancia. E falando do ensaio de fluxo lateral, hai certas condicións que os anticorpos deben ser capaces de facer. Primeiro de todo, os anticorpos deben estar activos incluso despois de conxugalos coas nanopartículas e a súa integridade estrutural non debe ser prexudicada de ningún xeito. Ademais, deben ter a capacidade de dar a súa reacción ao instante cando a mostra volva a ser rehidratada pola mostra. O tempo de incubación noutros tipos de ensaios é máis longo en comparación co ensaio de fluxo lateral no que a unión á liña de proba debe facerse nun período de poucos segundos.
O terceiro proceso neste proceso é unha membrana de nitrocelulosa e é unha parte moi importante do LFA xa que ten as liñas de proba e control. A membrana de nitrocelulosa ten tamén os reactivos que funcionan para producir os resultados. Está dispoñible en diferentes tamaños, porosidades e deseños. En realidade, a membrana de nitrocelulosa depende do tempo de fluxo capilar. Por tempo de fluxo capilar, significa que o tempo necesario para que a mostra flúa ata 4 cm. Neste paso, hai outro paso que se chama stripping de membrana. O tampón no que se raia unha proteína específica pode ter un impacto significativo nos resultados finais de calquera ensaio de fluxo lateral. Aínda que moitas proteínas poden disolverse en 1x PBS, algunhas son extremadamente sensibles ao pH, á concentración de sal e á aparición dun estabilizador polo que se pode nomear a trehalosa. O despezamento de membranas é outro paso importante que vén con este paso. Neste paso, o deseño da proba de ensaio de fluxo lateral consiste en eliminar a proba e controlar as liñas de anticorpos que están presentes na membrana de nitrocelulosa. Unha consideración importante neste paso é a membrana de nitrocelulosa onde se di que non mantén a membrana de nitrocelulosa nun lugar onde non hai humidade, máis ben seca. Para o desenvolvemento do ensaio de fluxo lateral, a temperatura da membrana de nitrocelulosa debe ser húmida. Como hai diferentes formatos de ensaios, é dicir, o formato competitivo e o formato sandwich que tamén son moi importantes. A concentración de anticorpos difire nos dous formatos para o formato sándwich; a concentración de anticorpos recomendada é de 1 mg / mL só para anticorpos da liña de proba e control e este límite pode variar de 0.5 a 2 mg / mL. No paso da membrana de nitrocelulosa e na guía de desenvolvemento do fluxo lateral, outro paso incluído é o paso de bloqueo da membrana. Facer este paso ten moitos beneficios como o fluxo mellorado do fluído, a estabilidade das tiras reactivas e o bloqueo da unión inespecífica dando así os verdadeiros resultados. Para a maioría da membrana de nitrocelulosa no ensaio de fluxo lateral, hai unha solución propietaria que se engade á para facer as membranas hidrófilas.
O seguinte paso é a almofada conxugada e conxugada. Para desenvolver un ensaio de fluxo lateral é importante desenvolver parámetros de conxugación optimizados. Cando se prepara un conxugado para o ensaio de fluxo lateral, é dispensado e secado nunha almofada conxugada. Para desenvolver unha conxugación estabilizada de anticorpos podería haber varios pasos. Os pasos implicados no desenvolvemento dunha eficacia cohesionada e mellorada da conxugación. Neste paso, a estabilidade da conxugación é un paso moi importante e, polo tanto, hai que optimizar a estabilidade coloidal ao deseñar o LFA. a estabilidade coloidal é moi esencial para o ensaio do fluxo lateral e, polo tanto, ao deseñar e optimizar o LFA, isto sempre se ten en conta. As nanopartículas de ouro que xogan un papel crucial na conxugación en LFA teñen características ópticas moi exclusivas coa axuda das cales absorben e dispersan a luz con precisión e eficacia. A forte interacción entre as nanopartículas e a luz ocorre debido aos electróns de condución que están presentes na superficie do metal e que dan lugar á oscilación colectiva cando os electróns se excitan pola luz coa mesma e igual frecuencia. Despois de ter unha conxugación exitosa, hai algúns efectos sobre as características ópticas, xa que se observa o cambio no índice de refracción que se pode rastrexar nos espectros de UV-vis pola distinción da liña vermella. Tamén para o tratamento da almofada de conxugación, podería haber diferentes métodos. Algúns deles son de inmersión ou pulverización uniforme coa axuda dun dispensador automatizado.
Despois disto, prodúcese o proceso de selección de almofadas de mostra. Esta é a primeira parte do fluxo lateral polo tanto, é esencial comprobar o material da almofada de mostra e o seu tratamento previo para o seu fluxo e eficacia. As almofadas empregadas para os ensaios de fluxo lateral son de diferentes tipos como fibra, algodón, sintético, etc. Tamén se observou que algunhas mostras como orina, sangue, etc. poden variarse debido a moitos outros factores que inclúen factores biolóxicos, o momento de comer, a bebida tomada antes da recollida da mostra no dispositivo de ensaio de fluxo lateral e moitos outros. Para tratar a almofada de mostra e optimizala pódese usar o buffer optimizado que tamén ten moitas vantaxes. Mentres se desenvolve o ensaio de fluxo lateral e se selecciona a almofada de mostra, o tampón ootmizado pode axudar a mellorar o rendemento do ensaio reducindo a variabilidade da mostra que inclúe proteínas, pH, viscosidade, a concentración de sal, etc. Tamén pode mellorar o fluxo e a consistencia do ensaio mentres se desenvolve. Os tampóns para o tratamento demostraron ser de gran axuda para manter o fluxo e a consistencia, normalizar o pH, funcionando como axentes de bloqueo mediante a fusión de proteínas, sales, surfactantes coa concentración adecuada de cada un. A especificación máis importante da almofada de mostra para comprobar é a capacidade de absorción porque iso fala do volume da mostra para unha proba.
Despois de seleccionar a almofada de mostra, a selección de almofada de mecha vén a continuación. A almofada axuda no proceso de adsorción dos reactivos que non foron tomados por ningunha das dúas liñas, é dicir, a liña de proba e as de control. A almofada tamén detén o fluxo cara atrás do fluído que se usa como mostra. Suxírese que, ao seleccionar o material para a almofada, debe comprobarse o material para gardar o dispositivo de calquera discrepancia que poida provocar problemas e quizais resultados falsos. Ademais do normal, o material groso ou a almofada non é mellor que o material máis fino. O material máis fino ten un mellor rendemento e normalmente ten o material de maior capacidade ás veces. Pero cada material debe comprobarse polas súas características e a súa idoneidade para o desenvolvemento do ensaio de fluxo lateral. Para seleccionar o tamaño e o material da almofada, cómpre mantela aliñada co factor de que a capacidade de absorción debe ser maior e o volume do buffer debe estar en funcionamento.
No ensaio de fluxo lateral, o conxunto de proba de tira tamén é o paso da súa guía de desenvolvemento. Na montaxe de probas de tira, os LFA están ensamblados en base a grandes fabricacións ou a pequena escala. Para algúns tipos de ensaios de fluxo lateral, a lectura cuantitativa pode non ser o requisito, pero o formato de varilla sería necesario para executar o conxunto de proba de tira en LFA. Hai un casete que ten unha proba de tira dentro é un dos pasos máis esenciais e cruciais para lograr o ensaio que sexa reproducible e tamén fiable. As dúas especificacións mencionadas anteriormente son extremadamente significativas para as probas cuantitativas, especialmente. O traballo principal do casete é proporcionar a presión requirida ao fluído. Isto é para garantir que exista un fluxo óptimo e que o fluído tamén pase polo conxunto no mesmo fluxo. O casete tamén se asegura de que o líquido non quede como resultado nos bordos e só flúa polas almofadas.
Despois da montaxe da proba de tira, o seguinte paso é executar o ensaio. Existen diferentes técnicas para realizar o ensaio, como o ensaio de distrito no conxugado líquido, ensaios completos para o conxugado seco e o tampón de execución. Para a análise da tira, débese saber que se a proba é cualitativa ou cuantitativa e se debe escoller o método de análise correcto. Para analizar o ensaio, pódese facer a simple vista no que habería resultados si / non ou capturando unha impresión da liña de proba, pódese usar un escáner plano ou unha cámara con iluminación controlada. O último paso é a optimización do ensaio no que se inclúe a elección do par de anticorpos axeitado, a membrana de nitrocelulosa, a mecha, a almofada adsorbente e todas as demais partes.
Conclusión:
o guía de desenvolvemento do Lateral Flow Assay ten entre nove e dez pasos que se deben seguir minuciosamente para crear un ensaio de fluxo lateral.
References
https://cdn.shopify.com/s/files/1/0257/8237/files/BioReady_Lateral_Flow_Handbook.pdf