זרימה רוחבית assay הוא המכשיר המשמש לבדיקות מהירות בבית וגם לבדיקות קליניות. הם המכשירים האמינים והמדויקים ביותר הנמצאים בשימוש כמעט בכל מדינה מפותחת ומתפתחת. וגם ה מבחן זרימה רוחבית מדריך פיתוח מכילה כמעט 10 שלבים הקובעים את תהליך הפיתוח של מבחן זרימה לרוחב. בְּדֶרֶך כְּלַל, מבחני זרימה לרוחב יש כרית מדגם, כרית מצומדת, קרום ניטרוצלולוזה, תווית כרית סופחת ומאגר. עם זאת, ייתכנו שינויים מסוימים בתוויות מכיוון שישנן תוויות שונות המשמשות במבחני הזרימה לרוחב.
כדי להתחיל את מדריך לפיתוח מבחני זרימה לרוחב, חשוב לקחת בחשבון כמה פעולות לפני שתתחיל בתהליך. קודם כל, חשוב לנתח את הפורמט הנבחר למבחן הזרימה לרוחב אם הוא יהיה בפורמט תחרותי או כריך. ביסודו של דבר, מדריך הפיתוח של מבחן הזרימה הרוחבית תלוי בתהליך פיתוח המבחן. השלב הקריטי והחשוב ביותר הוא לזהות את מבחן הבקרה שיסייע בזיהוי מנתח המטרה במדגם. מדריך פיתוח זה ייתן תהליך פיתוח כללי של LFA מכיוון שלמבחנים שונים יש תהליך שונה גם כן.
השלב הראשון ל מדריך פיתוח הוא מבחר חלקיקי הננו. מבחר החלקיקים משתנה בגודל ובצורה. קיימים גדלים שונים עבור מבחני הזרימה לרוחב. יש גם חלקיקי הזהב 40 ננומטר עם משטח פחמן או ציטראט שיכולים לשמש עוד יותר לתהליך הספיגה של חלבונים. חלקיקי הננו האחרים הניתנים לבחירה לפיתוח LFA כוללים זהב קרבוקסילי, ננו -פחזני זהב קרבוקסילי וכו 'פרט לכך שישנן בדיקות אחרות כגון חרוזי תאית, פוליסטירן צבוע וחקר פלורסנט. נקודת הפלוס בבחירת חלקיקי הזהב הקרבוקסילי היא שבעצם תהליך הספיחה נדרשים הרבה פחות נוגדנים ובשל חלקיקים אלו נוצר קשר שהוא קשר אמיד יציב ובלתי הפיך. עם זאת, יש לזכור כי הכוחות המתקבלים הנמצאים בין החלקיקים לנוגדנים נובעים מסביבת הצימוד שלהם.
השלב השני הוא בחירת נוגדנים. בחירת נוגדנים היא שלב קריטי מכיוון שהביצועים של ה- LFA תלויים בזיקה של הנוגדנים, הקינטיקה ומאפיינים סטריליים אחרים. כמו כן, קשירת הנוגדנים חשובה לאיתור התוצאות. גורם חשוב נוסף בעת בחירת הנוגדנים הוא שני סוגיהם. שני סוגי הנוגדנים הם חד שבטיים ופוליקלונליים. נוגדנים חד שבטיים קלים לייצור ואילו לנוגדנים פוליקלוניים יש רגישות גבוהה יחסית בהשוואה למונוקלונליים. בשלב של תהליך בחירת הנוגדן, ישנם שני שלבים נוספים, כלומר טיהור נוגדנים ונוגדן של קו בקרה. בבחירת הנוגדן, הגזע המוצע הוא לסנן את הנוגדנים מהסיבה שיש לבדוק אותם לפני כן. ניתן לסנן ולבדוק את הנוגדנים על ידי בניית גרסה ראשונית מאוד וראשונית של מבחן הזרימה לרוחב שיכולה לפעול כמכשיר לדוגמה. הביצועים של הנוגדנים שונים בסוג אחר של LFA. לדוגמה, ב- ELISA לקינטיקה אין חשיבות רבה. ואם מדברים על מבחן הזרימה לרוחב, ישנם תנאים מסוימים שנוגדנים חייבים להיות מסוגלים לבצע. ראשית כל, הנוגדנים צריכים להיות פעילים גם לאחר שהם חוברו לחלקיקים ואין לפגוע בשלמותם המבנית בשום צורה. כמו כן, עליהם להיות בעלי יכולת לתת את תגובתם באופן מיידי כאשר המדגם מתייבש שוב על ידי המדגם. זמן הדגירה בסוגים אחרים של מבחנים ארוך יותר בהשוואה למבחן הזרימה לרוחב בו יש לבצע את הכריכה לקו הבדיקה בטווח הזמן של מספר שניות.
התהליך השלישי בתהליך זה הוא קרום ניטרוצלולוזה והוא חלק חשוב מאוד ב- LFA מכיוון שיש לו את קווי הבדיקה והבקרה. לקרום ניטרוצלולוזה יש גם ריאגנטים הפועלים לייצור התוצאות. הוא זמין בגדלים, נקבוביות ועיצובים שונים. למעשה, קרום ניטרוצלולוזה תלוי בזמן הזרימה הנימי. על ידי זמן זרימה נימי, זה אומר שהזמן הדרוש לזרימה של המדגם עד 4 ס"מ. בשלב זה, יש שלב נוסף שנקרא הפשטת קרום. למאגר שבו חלבון ספציפי מפוספס יכולה להיות השפעה משמעותית על התוצאות הסופיות של כל מבחן זרימה רוחבי. למרות שניתן להמיס חלבונים רבים ב- 1x PBS, חלקם רגישים ביותר ל- pH, ריכוז המלח והופעת מייצב שאליו ניתן לקרוא trehalose. הפשטת ממברנות היא צעד חשוב נוסף שמגיע עם שלב זה. בשלב זה, תכנון בדיקת זרימת הרוחב לרוחב היא לפשט את הבדיקה ולשלוט בקווי הנוגדנים הקיימים על קרום ניטרוצלולוזה. שיקול חשוב בשלב זה הוא של קרום ניטרוצלולוזה שבו אומרים לא לשמור את קרום הניטרוצלולוזה במקום בו אין לחות אלא שהוא מיובש כולו. לפיתוח assay הזרימה לרוחב, הטמפרטורה של קרום ניטרוצלולוזה צריכה להיות לחה. מכיוון שישנם פורמטים שונים של מבחנים, כלומר פורמט תחרותי ופורמט סנדוויץ 'שהם גם חשובים מאוד. ריכוז הנוגדן שונה בשני הפורמטים של פורמט הסנדוויץ '. ריכוז הנוגדנים המומלץ הוא 1 מ"ג/מ"ל לנוגדי קו ובקרה בלבד ומגבלה זו יכולה לנוע עד 0.5 עד 2 מ"ג/מ"ל. בשלב הממברנה ניטרוצלולוזה ובמדריך פיתוח זרימה רוחבית, שלב נוסף שכלול הוא שלב חסימת הממברנה. לביצוע שלב זה יש יתרונות רבים כגון זרימת הנוזל המשופרת, יציבות רצועות הבדיקה וחסימת הקישור הלא ספציפי ובכך מניבים את התוצאות האמיתיות. עבור רוב הממברנה ניטרוצלולוזה במבחן הזרימה לרוחב, קיים פתרון קנייני המתווסף להפיכת הממברנות להידרופיליות.
השלב הבא הוא כרית הצמודה והמצמודה. לפיתוח assay זרימה לרוחב חשוב לפתח אופטימיזציה של פרמטרים מצמידים. כאשר מצומדים מוכנים למבחן הזרימה הרוחבית הוא נמס ויובש על כרית מצומדת. לפיתוח הצמדה מיוצבת של נוגדנים יכולים להיות מספר שלבים. השלבים הכרוכים בפיתוח יעילות מגובשת ומשופרת של הצמידה. בשלב זה, יציבות ההצמדה היא שלב חשוב מאוד ולכן, יש לייעל את היציבות הקולואידית בעת תכנון ה- LFA. היציבות הקולואידית חיונית מאוד למבחן הזרימה לרוחב ולכן בעת תכנון ואופטימיזציה של ה- LFA זה תמיד נשמר בשיקולים. לחלקיקי הזהב שממלאים תפקיד מכריע בצמידה ב- LFA יש מאפיינים אופטיים ייחודיים מאוד בעזרתם הם סופגים ומפזרים את האור בדיוק ויעילות. האינטראקציה החזקה בין חלקיקי האור לאור מתרחשת עקב אלקטרונים ההולכה הקיימים על משטח המתכת אשר גורמים לתנודה הקולקטיבית כאשר האלקטרונים מתרגשים מהאור בתדירות זהה ושווה. לאחר שקיימת הצמדה מוצלחת ישנן כמה השפעות על המאפיינים האופטיים כאשר השינוי נצפה במדד השבירה אשר ניתן לעקוב אחר בספקטרום ה- UV-vis על ידי הבחנה של הקו האדום. גם לטיפול בכרית הצמידה יכולות להיות שיטות שונות. חלקם טבילה, או ריסוס אחיד בעזרת מתקן אוטומטי.
לאחר מכן, מתרחש תהליך בחירת משטח הדגימה. זהו החלק הראשון של ה זרימה לרוחב וזאת לכן חיוני לבדוק את חומר המשטח המדגם והטיפול המוקדם של כרית הדגימה על זרימתו ויעילותו. רפידות הדגימה המשמשות למבחני הזרימה לרוחב הינם מסוגים שונים כגון סיבים, כותנה, סינטטי וכו '. עוד נצפתה כי חלק מהדגימות כגון שתן, דם וכו' יכולות להיות מגוונות בשל גורמים רבים אחרים אשר כוללים גורמים ביולוגיים, תזמון אכילה, שתייה שנלקחה לפני איסוף הדגימה במכשיר לבדיקת הזרימה לרוחב, ועוד רבים אחרים. לטיפול בכרית המדגם ולאופטימיזציה ניתן להשתמש במאגר המיטוב שיש לו גם יתרונות רבים. בעת פיתוח assay הזרימה לרוחב, ובחירת כרית הדגימה המאגר המוטמע יכול לעזור לשפר את ביצועי המבחן על ידי הפחתת השתנות המדגם הכולל חלבון, pH, צמיגות, ריכוז המלח וכו '. הוא יכול גם לשפר הזרימה והעקביות של המבחן בזמן שהוא מפותח. מאגרי טיפול הוכחו כמסייעים ביותר בשמירה על הזרימה והעקביות, נורמליזציה של ה- pH, עבודה כסוכני חסימה על ידי מיזוג החלבונים, המלחים, חומרי השטח עם הריכוז המתאים של כל אחד מהם. המפרט החשוב ביותר של משטח הדגימה לבדיקה הוא כושר הספיגה מכיוון שהוא מספר על נפח הדגימה לבדיקה.
לאחר בחירת משטח הדגימה בחירת כרית הפתילה מגיעה הבאה. כרית הפתילה מסייעת בתהליך הספיגה של הריאגנטים שלא נקלטו על ידי אף אחד מהקו, כלומר קו הבדיקה וקווי הבקרה. כרית הפתילה גם עוצרת את הזרימה לאחור של הנוזל המשמש כדגימה. מוצע כי בעת בחירת החומר לרפידת הפתילה יש לבדוק את החומר כדי להציל את המכשיר מכל אי התאמה שעלולה להוביל לבעיות ואולי לתוצאות שווא. מלבד הנורמלי, החומר הסמיך או כרית הפתילה אינם טובים יותר מהחומר הדק יותר. החומר הדק יותר טוב בביצועים טובים יותר ובדרך כלל יש לו לפעמים את החומר בעל הקיבולת הגבוהה יותר. אך יש לבדוק כל חומר למאפייניו והתאמתו לפיתוח מבחן הזרימה לרוחב. לבחירת הגודל והחומר של כרית הפתילה נדרש לשמור על התאמה לגורם שיכולת הספיגה חייבת להיות גבוהה יותר ונפח החיץ חייב לפעול.
במבחן הזרימה לרוחב, מכלול בדיקת הרצועות הוא גם השלב של מדריך הפיתוח שלה. בהרכבת בדיקת רצועות, LFAs מורכבים על בסיס ייצור גדול או ייצור בקנה מידה קטן. עבור סוגים מסוימים של מבחני זרימה רוחביים, ייתכן שהקריאה הכמותית אינה הדרישה, אך יהיה צורך בפורמט מדיסטיק להפעלת מכלול בדיקת הרצועות ב- LFA. יש קלטת עם מבחן רצועה בפנים היא אחד השלבים החיוניים והחיוניים ביותר להשגת הבדיקה שהיא ניתנת לשחזור וגם אמינה. שני המפרטים שהוזכרו לעיל הם משמעותיים ביותר עבור הבדיקות הכמותיות, במיוחד. העבודה העיקרית של הקלטת היא לספק את הלחץ הנדרש לנוזל. זאת על מנת להבטיח שיש את הזרימה האופטימלית והנוזל עובר גם במכלול באותה זרימה. הקלטה גם מוודאת שהנוזל לא יישאר תוצאות בקצוות ורק יזרום על הרפידות.
לאחר מכלול בדיקת הרצועה, השלב הבא הוא הפעלת המבחן. ישנן טכניקות שונות להפעלת המבחן כגון מבחן מחוזי בצמד הנוזלים, מבחנים מלאים לצמודה מיובשת ומאגר הריצה. לצורך ניתוח הרצועה, יש לדעת כי האם הבדיקה איכותית או כמותית ויש לבחור את שיטת הניתוח הנכונה. כדי לנתח את הבדיקה, ניתן לבצע זאת בעין בלתי מזוינת שבה יהיו תוצאות כן/לא או על ידי צילום רושם מקו הבדיקה, ניתן להשתמש בסורק שטוח או במצלמה עם תאורה מבוקרת. השלב האחרון הוא אופטימיזציה של הבדיקה שבה נכללים בחירת הזוג הנוגדן הנכון, קרום ניטרוצלולוזה, כרית פתילה, כרית ספיחה וכל החלקים האחרים.
סיכום:
השמיים מדריך פיתוח של Assay Flow Lateral הוא תשעה עד עשרה שלבים המסופקים אשר יש לבצע אותם ביסודיות ליצירת מבחן זרימה רוחבי.
הפניות
https://cdn.shopify.com/s/files/1/0257/8237/files/BioReady_Lateral_Flow_Handbook.pdf
