Ontwikkelingsgids voor laterale-flow-assays
De laterale flow- assay (LFA) is een apparaat dat gebruikt wordt voor snelle tests thuis en voor klinische tests. Het is een van de meest betrouwbare en nauwkeurige apparaten en wordt gebruikt in vrijwel alle ontwikkelde en ontwikkelingslanden. De ontwikkelingshandleiding voor een LFA bestaat uit ongeveer tien stappen die het ontwikkelingsproces van een LFA beschrijven. Een LFA bestaat doorgaans uit een monsterpad, een conjugaatpad, een nitrocellulosemembraan, een adsorberend labelpad en een buffer. De labels kunnen echter variëren, aangezien er verschillende labels gebruikt worden voor LFA's.
Om te beginnen met de ontwikkeling van een laterale flow-assay , is het belangrijk om een aantal stappen te overwegen voordat het proces van start gaat. Allereerst is het belangrijk om te bepalen welk formaat de laterale flow-assay zal hebben, of het nu een competitief of een sandwichformaat is. De ontwikkelingshandleiding voor de laterale flow-assay is in principe afhankelijk van het assay-ontwikkelingsproces. De eerste en belangrijkste stap is het identificeren van een controle-assay die helpt bij het identificeren van de doelanalyt in het monster. Deze ontwikkelingshandleiding geeft een algemeen beeld van het LFA-ontwikkelingsproces, aangezien verschillende assays ook een verschillend proces hebben.
De eerste stap in de ontwikkelingshandleiding is de selectie van nanodeeltjes. De selectie van nanodeeltjes varieert in grootte en vorm. Er zijn verschillende groottes beschikbaar voor laterale flow-assays. Er zijn bijvoorbeeld 40 nm gouden nanodeeltjes met een koolstof- of citraatoppervlak die verder gebruikt kunnen worden voor het adsorptieproces van eiwitten. Andere nanodeeltjes die geselecteerd kunnen worden voor de ontwikkeling van LFA zijn onder andere carboxylgoud, carboxylgoud nanoschelpen, enzovoort. Daarnaast zijn er andere probes zoals cellulosekorrels, gekleurd polystyreen en fluorescerende probes. Het voordeel van de keuze voor carboxylgoud nanodeeltjes is dat er voor het adsorptieproces veel minder antilichamen nodig zijn en dat deze nanodeeltjes een stabiele en irreversibele amidebinding vormen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat de krachten die ontstaan tussen de nanodeeltjes en antilichamen het gevolg zijn van hun koppelingsomgeving.
De tweede stap is de selectie van antilichamen. Antilichaamselectie is een cruciale stap omdat de prestaties van de LFA's afhankelijk zijn van de affiniteit van de antilichamen, kinetiek en andere sterische eigenschappen. Ook de binding van antilichamen is belangrijk voor de detectie van de resultaten. Een andere belangrijke factor bij het selecteren van de antilichamen zijn de twee soorten ervan. De twee soorten antilichamen zijn monoklonaal en polyklonaal. Monoklonale antilichamen zijn gemakkelijk te vervaardigen, terwijl polyklonale antilichamen een relatief hoge gevoeligheid hebben in vergelijking met monoklonale. In de stap van het antilichaamselectieproces zijn er nog twee stappen, namelijk antilichaamzuivering en controlelijnantilichaam. Bij de antilichaamselectie wordt voorgesteld om de antistoffen te screenen op de reden dat ze vooraf moeten worden getest. De antilichamen kunnen worden gescreend en getest door een zeer voorlopige en eerste versie van de laterale-flow-assay te bouwen die als een testmonsterapparaat kan werken. De werking van de antilichamen is anders in een ander soort LFA's. In ELISA is de kinetiek bijvoorbeeld niet van groot belang. En over de laterale flow-assay gesproken, er zijn bepaalde voorwaarden waaraan antilichamen moeten kunnen voldoen. Ten eerste moeten de antilichamen actief zijn, zelfs nadat ze zijn geconjugeerd met de nanodeeltjes en mag hun structurele integriteit op geen enkele manier worden geschaad. Ook moeten ze het vermogen hebben om onmiddellijk hun reactie te geven wanneer het monster opnieuw wordt gehydrateerd door het monster. De incubatietijd bij andere soorten assays is langer in vergelijking met de lateral flow assay waarbij de binding aan de testlijn binnen een tijdsbestek van enkele seconden moet worden uitgevoerd.
Het derde proces in dit proces is een nitrocellulosemembraan en het is een zeer belangrijk onderdeel van de LFA omdat het de test- en controlelijnen heeft. Het nitrocellulosemembraan heeft ook de reagentia die werken om de resultaten te produceren. Het is verkrijgbaar in verschillende maten, porositeiten en designs. Eigenlijk is het nitrocellulosemembraan afhankelijk van de capillaire stroomtijd. Met capillaire stroomtijd betekent dit dat de tijd die nodig is om het monster te laten stromen tot 4 cm kan bedragen. In deze stap is er nog een stap die membraanstrippen wordt genoemd. De buffer waarin een specifiek eiwit is gestreept, kan een significante invloed hebben op de uiteindelijke resultaten van een laterale flow-assay. Hoewel veel eiwitten kunnen worden opgelost in 1x PBS, zijn sommige extreem gevoelig voor pH, zoutconcentratie en het voorkomen van een stabilisator waarvoor trehalose kan worden genoemd. Membraanstrippen is een andere belangrijke stap die bij deze stap hoort. In deze stap is het ontwerp van de laterale stroomtesttest om de test te strippen en de antilichaamlijnen die aanwezig zijn op het nitrocellulosemembraan te controleren. Een belangrijke overweging bij deze stap is het nitrocellulosemembraan, waarvan wordt gezegd dat het het nitrocellulosemembraan niet op een plaats houdt waar geen vocht is, maar het is allemaal gedroogd. Voor de ontwikkeling van de laterale stroomtest moet de temperatuur voor het nitrocellulosemembraan vochtig zijn. Aangezien er verschillende formaten van testen zijn, dwz competitief formaat en sandwichformaat, zijn deze ook erg belangrijk. De antilichaamconcentratie verschilt in beide formaten voor het sandwichformaat. De aanbevolen antilichaamconcentratie is 1 mg/ml voor alleen test- en controlelijnantilichamen en deze limiet kan oplopen tot 0.5 tot 2 mg/ml. In de nitrocellulosemembraanstap en laterale stroomontwikkelingsgids, is een andere stap opgenomen de membraanblokkeringsstap. Het uitvoeren van deze stap heeft veel voordelen, zoals de verbeterde stroom van de vloeistof, de stabiliteit van de teststrips en het blokkeren van de niet-specifieke binding, waardoor de echte resultaten worden verkregen. Voor het grootste deel van het nitrocellulosemembraan in de laterale stroomtest is er een gepatenteerde oplossing die wordt toegevoegd om de membranen hydrofiel te maken.
De volgende stap is de geconjugeerde en geconjugeerde pad. Voor het ontwikkelen van een laterale flow-assay is het belangrijk om het optimaliseren van conjugerende parameters te ontwikkelen. Wanneer een conjugaat wordt bereid voor de laterale stroomtest, wordt het gedistribueerd en gedroogd op een geconjugeerd kussentje. Voor het ontwikkelen van een gestabiliseerde conjugatie van antilichamen kunnen er verschillende stappen zijn. De stappen die betrokken zijn bij het ontwikkelen van een samenhangende en verbeterde werkzaamheid van de conjugatie. In deze stap is conjugatiestabiliteit een zeer belangrijke stap en daarom moet de colloïdale stabiliteit worden geoptimaliseerd tijdens het ontwerpen van de LFA. de colloïdale stabiliteit is zeer essentieel voor de laterale flow-assay en daarom wordt dit altijd in overweging genomen bij het ontwerpen en optimaliseren van de LFA. De gouden nanodeeltjes die een cruciale rol spelen bij de conjugatie in LFA hebben zeer unieke optische eigenschappen waarmee ze het licht nauwkeurig en doeltreffend absorberen en verspreiden. De sterke interactie tussen de nanodeeltjes en licht vindt plaats door de geleidingselektronen die op het metalen oppervlak aanwezig zijn en die resulteren in de collectieve oscillatie wanneer de elektronen met dezelfde en gelijke frequentie door het licht worden geëxciteerd. Nadat er een succesvolle conjugatie is, zijn er enkele effecten op de optische kenmerken, aangezien de verandering wordt waargenomen in de brekingsindex die verder kan worden getraceerd in de spectra van UV-vis door het onderscheid van de rode lijn. Ook voor de behandeling van het conjugatiekussen kunnen er verschillende methoden zijn. Sommigen van hen zijn onderdompeling of gelijkmatig sproeien met behulp van een geautomatiseerde dispenser.
Hierna volgt het selectieproces van het monsterkussentje. Dit is het eerste deel van de laterale flow -assay, daarom is het essentieel om het materiaal van het monsterkussentje te controleren en de voorbehandeling ervan te beoordelen op doorstroming en effectiviteit. De monsterkussentjes die voor laterale flow-assays worden gebruikt, zijn er in verschillende soorten, zoals vezels, katoen, synthetisch materiaal, enzovoort. Het is ook gebleken dat sommige monsters, zoals urine en bloed, kunnen variëren als gevolg van diverse factoren, waaronder biologische factoren, het tijdstip van eten, drinken vóór de monstername met het laterale flow-assayapparaat, en vele andere. Voor de behandeling en optimalisatie van het monsterkussentje kan een geoptimaliseerde buffer worden gebruikt, wat ook vele voordelen biedt. Tijdens de ontwikkeling van de laterale flow-assay en de selectie van het monsterkussentje kan de geoptimaliseerde buffer de prestaties van de assay verbeteren door de variabiliteit van het monster te verminderen, zoals eiwitgehalte, pH-waarde, viscositeit, zoutconcentratie, enzovoort. Het kan ook de doorstroming en de consistentie van de assay verbeteren tijdens de ontwikkeling. Behandelingsbuffers zijn zeer nuttig gebleken voor het behouden van de doorstroming en consistentie, het normaliseren van de pH en het fungeren als blokkerende middelen door de combinatie van eiwitten, zouten en oppervlakteactieve stoffen in de juiste concentratie. De belangrijkste specificatie van het monsterkussen om te controleren is het absorptievermogen, omdat dit informatie geeft over het monstervolume voor een test.
Nadat de samplepad is geselecteerd, volgt de selectie van de wickpad. Het vochtafvoerende kussen helpt bij het adsorptieproces van de reagentia die door geen van beide lijnen zijn opgenomen, dwz testlijn en controlelijnen. Het wicking pad stopt ook de terugstroming van de vloeistof die als monster wordt gebruikt. Er wordt gesuggereerd dat bij het selecteren van het materiaal voor het vochtafvoerende kussen het materiaal moet worden gecontroleerd om het apparaat te beschermen tegen eventuele afwijkingen die kunnen leiden tot problemen en mogelijk onjuiste resultaten. Anders dan het normale, is het dikke materiaal of het vochtafvoerende kussen niet beter dan het dunnere materiaal. Het dunnere materiaal presteert beter en heeft soms materiaal met een hogere capaciteit. Maar elk materiaal moet worden gecontroleerd op zijn kenmerken en hun geschiktheid voor de ontwikkeling van de laterale flow-assay. Voor het selecteren van de maat en het materiaal van het wicking pad is het nodig om het in lijn te houden met de factor dat het absorptievermogen hoger moet zijn en het buffervolume moet lopen.
In de laterale flow-assay is de striptestassemblage ook de stap van de ontwikkelingsgids. Bij striptestassemblage worden de LFA's geassembleerd op basis van grootschalige productie of kleinschalige productie. Voor sommige soorten laterale-flow-assays is de kwantitatieve uitlezing misschien niet de vereiste, maar het formaat van de peilstok is vereist voor het uitvoeren van de striptestassemblage in LFA. Er is een cassette met een striptest erin, dit is een van de meest essentiële en cruciale stappen om de test te bereiken die reproduceerbaar en ook betrouwbaar is. De twee eerder genoemde specificaties zijn vooral voor de kwantitatieve tests van groot belang. Het belangrijkste werk van de cassette is om de vloeistof van de vereiste druk te voorzien. Dit is om ervoor te zorgen dat er een optimale stroom is en dat de vloeistof ook met dezelfde stroom door het samenstel gaat. De cassette zorgt er ook voor dat de vloeistof niet achterblijft op de randen en gewoon op de pads vloeit.
Na de striptestassemblage is de volgende stap het uitvoeren van de test. Er zijn verschillende technieken om de test uit te voeren, zoals districtstest in het vloeibare conjugaat, volledige testen voor gedroogd conjugaat en de lopende buffer. Voor de analyse van de strip moet bekend zijn of de test kwalitatief of kwantitatief is en de juiste analysemethode moet worden gekozen. Om de test te analyseren, kan dit met het blote oog worden gedaan, waarbij er ja/nee-resultaten zijn, of door een afdruk van de testlijn te maken, een flatbedscanner of een camera met gecontroleerde verlichting. De laatste stap is de optimalisatie van de test waarbij het kiezen van het juiste antilichaampaar, nitrocellulosemembraan, lontkussen, adsorberend kussen en alle andere onderdelen zijn inbegrepen.
Conclusie:
De ontwikkelingshandleiding voor de laterale flow-assay bestaat uit negen tot tien stappen die nauwgezet gevolgd moeten worden voor het creëren van een laterale flow-assay.
Referenties
https://cdn.shopify.com/s/files/1/0257/8237/files/BioReady_Lateral_Flow_Handbook.pdf