Водич за развој анализе латералног тока
Тест латералног протока је уређај који се користи за брзо тестирање код куће, а такође и за клиничка испитивања. То су најпоузданији и најтачнији уређаји који се користе у скоро свакој развијеној и земљи у развоју. Такође, Водич за развој теста латералног протока има скоро 10 корака који одређују процес развоја теста латералног протока. Обично, тестови латералног протока имају подлогу за узорак, подлогу за коњугацију, нитроцелулозну мембрану, подлогу за адсорбент са етикетама и пуфер. Међутим, може доћи до неких промена у етикетама јер постоје различите етикете које се користе у тестовима латералног протока.
Да бисте започели са водичем за развој анализе латералног протока , важно је размотрити неколико корака пре почетка процеса. Пре свега, важно је анализирати формат који ће бити изабран за анализу латералног протока, да ли ће бити конкурентни или сендвич формат. У основи, водич за развој анализе латералног протока зависи од процеса развоја анализе. Први критични и најважнији корак је идентификација контролне анализе која ће помоћи у идентификацији циљног аналита у узорку. Овај водич за развој ће дати општи процес развоја ЛФА, јер различити анализе имају и различите процесе.
Први корак ка развојном водичу је избор наночестица. Избор наночестица варира по величини и облику. Доступне су различите величине за тестове латералног тока. Ту су и златне наночестице од 40 нм са угљеничном или цитратном површином које се могу даље користити за процес адсорпције протеина. Остале наночестице које се могу одабрати за развој ЛФА укључују карбоксилно злато, карбоксилно златне нанољуске итд. Осим тога, постоје и друге сонде као што су целулозне перле, обојени полистирен и флуоресцентне сонде. Предност избора карбоксилно златних наночестица је у томе што је за процес адсорпције потребно веома мање антитела и због ових наночестица формира се веза која је стабилна и иреверзибилна амидна веза. Међутим, мора се имати на уму да су резултујуће силе које се налазе између наночестица и антитела последица њиховог окружења за спрезање.
Други корак је избор антитела. Избор антитела је критичан корак јер перформансе ЛФА зависе од афинитета антитела, кинетике и других стеричких својстава. Такође, везивање антитела важно је за откривање резултата. Још један важан фактор при избору антитела су две њихове врсте. Два типа антитела су моноклонска и поликлонска. Моноклонска антитела се лако производе, док поликлонска антитела имају релативно високу осетљивост у поређењу са моноклонским. У кораку процеса одабира антитела, постоје још два корака, тј. Пречишћавање антитела и антитело контролне линије. У избору антитела, предложено стабло је да се антитела прегледају из разлога што их треба претходно тестирати. Антитела се могу прегледати и тестирати изградњом врло прелиминарне и почетне верзије теста бочног протока који може да функционише као уређај за испитивање узорка. Перформансе антитела су различите у различитим врстама ЛФА. На пример, у ЕЛИСА -и кинетика није од великог значаја. А говорећи о тесту латералног тока, постоје одређена стања која антитела морају да испуне. Пре свега, антитела би требало да буду активна чак и након што су коњугована са наночестицама и њихов структурни интегритет не би смео бити нарушен на било који начин. Такође, морају имати способност да одмах дају своју реакцију када се узорак поново рехидрира. Време инкубације у другим врстама тестова је дуже у поређењу са тестом латералног тока у коме се везивање за тестну линију мора извршити у року од неколико секунди.
Трећи процес у овом процесу је нитроцелулозна мембрана и веома је важан део ЛФА јер има испитне и контролне линије. Митроцелулозна мембрана има и реагенсе који раде на постизању резултата. Доступан је у различитим величинама, порозностима и дизајном. Заправо, нитроцелулозна мембрана зависи од времена протока капилара. Време капиларног протока значи да је потребно време да узорак тече до 4 цм. У овом кораку постоји још један корак који се назива скидање мембране. Пуфер у којем је специфичан протеин пругаста може имати значајан утицај на коначне резултате било ког теста бочног тока. Иако се многи протеини могу растворити у 1к ПБС, неки су изузетно осетљиви на пХ, концентрацију соли и појаву стабилизатора по којима се трехалоза може назвати. Скидање мембране је још један важан корак који долази са овим кораком. У овом кораку, дизајн теста за испитивање латералног тока је да се тест пробије и контролише линије антитела које су присутне на нитроцелулозној мембрани. Важан фактор у овом кораку је нитроцелулозна мембрана за коју се каже да не држи нитроцелулозну мембрану на месту где нема влаге, већ је сва осушена. За развој теста бочног протока, температура за нитроцелулозну мембрану треба да буде влажна. Пошто постоје различити формати тестова, односно такмичарски формат и формат сендвича који су такође веома важни. Концентрација антитела се разликује у оба формата за сендвич формат, препоручена концентрација антитела је 1 мг/мЛ само за антитела за тест и контролну линију, а ова граница може да се креће до 0.5 до 2 мг/мЛ. У кораку нитроцелулозне мембране и водичу за развој бочног тока, још један укључени корак је корак блокирања мембране. Извођење овог корака има многе предности, попут побољшаног протока течности, стабилности тест трака и блокирања неспецифичног везивања, што даје праве резултате. За већину нитроцелулозних мембрана у тесту латералног тока, постоји власнички раствор који се додаје за израду мембрана хидрофилним.
Следећи корак је коњугат и коњуговани јастучић. За развој теста латералног тока важно је развити оптимизирајуће параметре коњугације. Када се коњугат припреми за испитивање латералног тока, он се распршује и осуши на подлози од коњугата. За развој стабилизоване коњугације антитела могло би бити неколико корака. Кораци укључени у развој кохезивне и побољшане ефикасности коњугације. У овом кораку, стабилност коњугације је врло важан корак, па се колоидна стабилност мора оптимизирати приликом дизајнирања ЛФА. колоидна стабилност је веома битна за испитивање латералног тока, па се приликом пројектовања и оптимизације ЛФА то увек има у виду. Наночестице злата које играју кључну улогу у коњугацији у ЛФА имају врло јединствене оптичке карактеристике помоћу којих апсорбују и распршују светлост са тачношћу и ефикасношћу. Снажна интеракција између наночестица и светлости настаје услед електрона проводљивости присутних на површини метала који резултирају колективним осцилацијама када се електрони побуђују светлошћу са истом и једнаком фреквенцијом. Након што је коњугација успјешна, постоје неки ефекти на оптичке карактеристике јер се уочава промјена индекса лома која се даље може пратити у спектрима УВ-вида разликовањем црвене линије. Такође за лечење коњугационог јастучића, могу постојати различите методе. Неки од њих су потапање или равномерно прскање уз помоћ аутоматизованог дозатора.
Након тога, следи процес избора подлоге за узорак. Ово је први део анализе латералног протока , стога је неопходно проверити материјал подлоге за узорак и претходну обраду подлоге за узорак ради њеног протока и ефикасности. Подлоге за узорке које се користе за анализе латералног протока су различитих врста, као што су влакна, памук, синтетика итд. Такође је примећено да се неки узорци, попут урина, крви итд., могу разликовати због многих других фактора, који укључују биолошке факторе, време оброка, пиће узето пре узимања узорка на уређају за анализу латералног протока и многе друге. За третман подлоге за узорак и њену оптимизацију може се користити оптимизовани пуфер, који такође има многе предности. Приликом развоја анализе латералног протока и избора подлоге за узорак, оптимизовани пуфер може помоћи у побољшању перформанси анализе смањењем варијабилности узорка која укључује протеине, pH, вискозност, концентрацију соли итд. Такође може побољшати проток и конзистентност анализе док се развија. Пуфери за третман су се показали као изузетно корисни у одржавању протока и конзистенције, нормализацији pH вредности, делујући као блокирајући агенси спајањем протеина, соли, сурфактаната са одговарајућом концентрацијом сваког од њих. Најважнија спецификација узорка коју треба проверити је капацитет апсорпције, јер то говори о запремини узорка за тест.
Након што је изабран узорак јастучића, следи избор фитилисте. Јастучић за упијање помаже у процесу адсорпције реагенса које није узела ниједна линија, тј. Испитна линија и контролне линије. Усисни јастучић такође зауставља повратни ток течности која се користи као узорак. Предлаже се да при одабиру материјала за подлогу за упијање материјала треба проверити како би се уређај сачувао од било каквих одступања која могу довести до проблема, а можда и лажних резултата. Осим уобичајеног, густи материјал или подлога за упијање нису бољи од тањег материјала. Тањи материјал боље ради и обично има материјал већег капацитета понекад. Али сваки материјал се мора проверити у погледу његових карактеристика и погодности за развој теста бочног тока. За одабир величине и материјала упијајућег јастучића потребно га је држати у складу са фактором да апсорпциони капацитет мора бити већи, а запремина пуфера мора бити активна.
У тесту бочног тока, склоп за тестирање траке је такође корак у његовом развојном водичу. У монтажи тест трака, ЛФА се састављају на основу велике производње или мале производње. За неке врсте испитивања латералног протока, квантитативно очитавање можда није захтев, али би формат мерне шипке био потребан за покретање склопа за тестирање траке у ЛФА. Постоји касета која има стрип тест један је од најважнијих и кључних корака за постизање теста који је поновљив и такође поуздан. Две претходно наведене спецификације су изузетно значајне за квантитативне тестове, посебно. Главни посао касете је да обезбеди потребан притисак течности. Тиме се осигурава оптималан проток и течност такође пролази кроз склоп при истом протоку. Касета такође води рачуна да течност не остане на ивицама и само тече по јастучићима.
Након монтаже тест траке, следећи корак је покретање теста. Постоје различите технике за извођење теста, као што је дистриктни тест у течном коњугату, потпуни тестови за осушени коњугат и пуфер који ради. За анализу траке мора се знати да ли је тест квалитативан или квантитативан и мора се изабрати прави метод анализе. За анализу теста, то се може урадити голим оком у којем би било да/не резултата или снимањем утиска тестне линије, може се користити равни скенер или камера са контролисаним осветљењем. Последњи корак је оптимизација теста у који је укључен одабир правог пара антитела, нитроцелулозне мембране, фитиљног јастучића, адсорбентног јастучића и свих осталих делова.
Закључак:
Водич за развој теста латералног протока састоји се од девет до десет корака који се морају пажљиво пратити за креирање теста латералног протока.
Референце
https://cdn.shopify.com/s/files/1/0257/8237/files/BioReady_Lateral_Flow_Handbook.pdf