Guida allo sviluppo del saggio a flusso laterale
Flusso laterale saggio è il dispositivo che viene utilizzato per i test rapidi a casa e anche per i test clinici. Sono i dispositivi più affidabili e precisi utilizzati in quasi tutti i paesi sviluppati e in via di sviluppo. Anche il saggio di flusso laterale Guida allo sviluppo ha quasi 10 passaggi che determinano il processo di sviluppo di un saggio a flusso laterale. Generalmente, Saggi a flusso laterale avere un tampone per campioni, tampone per coniugato, membrana di nitrocellulosa, tampone assorbente per etichette e tampone. Tuttavia, potrebbero esserci dei cambiamenti nelle etichette poiché ci sono diverse etichette che vengono utilizzate nei saggi di flusso laterale.
Per avviare il guida allo sviluppo del dosaggio del flusso laterale, è importante considerare alcune azioni prima di iniziare il processo. Innanzitutto è importante analizzare il formato da scegliere per il saggio a flusso laterale, sia esso competitivo oa sandwich. Fondamentalmente, la guida allo sviluppo del saggio a flusso laterale dipende dal processo di sviluppo del saggio. Il primo passaggio critico e più importante è identificare il test di controllo che aiuterà a identificare l'analita target nel campione. Questa guida allo sviluppo fornirà un processo di sviluppo LFA generale perché diversi test hanno anche un processo diverso.
Il primo passo per il guida allo sviluppo è la selezione delle nanoparticelle. La selezione delle nanoparticelle varia in dimensioni e forma. Sono disponibili diverse dimensioni per i saggi a flusso laterale. Arrivano anche le nanoparticelle d'oro da 40 nm con superficie di carbonio o citrato che possono essere ulteriormente utilizzate per il processo di adsorbimento delle proteine. Le altre nanoparticelle che possono essere selezionate per lo sviluppo di LFA includono oro carbossilico, nanoguscio di oro carbossilico, ecc. Oltre a ciò ci sono altre sonde come perline di cellulosa, polistirene colorato e sonde fluorescenti. Il punto a favore della selezione delle nanoparticelle di carbossi oro è che per il processo di adsorbimento sono necessari pochissimi anticorpi e grazie a queste nanoparticelle si forma un legame che è un legame ammidico stabile e irreversibile. Tuttavia, va tenuto presente che le forze risultanti che si trovano tra le nanoparticelle e gli anticorpi sono dovute al loro ambiente di accoppiamento.
Il secondo passo è la selezione dell'anticorpo. La selezione degli anticorpi è un passaggio critico poiché le prestazioni degli LFA dipendono dall'affinità degli anticorpi, dalla cinetica e da altre proprietà steriche. Inoltre, il legame degli anticorpi è importante per la rilevazione dei risultati. Un altro fattore importante durante la selezione degli anticorpi sono i due tipi di essi. I due tipi di anticorpi sono monoclonali e policlonali. Gli anticorpi monoclonali sono facili da produrre mentre gli anticorpi policlonali hanno una sensibilità relativamente elevata rispetto ai monoclonali. Nella fase del processo di selezione dell'anticorpo, ci sono altre due fasi, ovvero la purificazione dell'anticorpo e l'anticorpo della linea di controllo. Nella selezione dell'anticorpo, lo stelo suggerito è quello di schermare gli anticorpi per il motivo che dovrebbero essere testati in anticipo. Gli anticorpi possono essere selezionati e testati costruendo una versione molto preliminare e iniziale del saggio a flusso laterale che può funzionare come dispositivo per campioni di prova. Le prestazioni degli anticorpi sono diverse in un diverso tipo di LFA. Ad esempio, in ELISA la cinetica non ha molta importanza. E parlando del test del flusso laterale, ci sono alcune condizioni che gli anticorpi devono essere in grado di fare. Innanzitutto gli anticorpi dovrebbero essere attivi anche dopo essere stati coniugati con le nanoparticelle e la loro integrità strutturale non dovrebbe essere in alcun modo danneggiata. Inoltre, devono avere la capacità di dare istantaneamente la loro reazione quando il campione viene nuovamente reidratato dal campione. Il tempo di incubazione in altri tipi di saggi è più lungo rispetto al saggio a flusso laterale in cui il legame alla linea del test deve essere eseguito nell'arco di pochi secondi.
Il terzo processo in questo processo è una membrana di nitrocellulosa ed è una parte molto importante dell'LFA in quanto ha le linee di test e controllo. La membrana di nitrocellulosa ha anche i reagenti che lavorano per produrre i risultati. È disponibile in diverse dimensioni, porosità e design. In realtà, la membrana di nitrocellulosa dipende dal tempo di flusso capillare. Per tempo di flusso capillare, significa che il tempo necessario affinché il campione fluisca fino a 4 cm. In questo passaggio, c'è un altro passaggio chiamato strippaggio della membrana. Il tampone in cui viene strippata una specifica proteina può avere un impatto significativo sui risultati finali di qualsiasi analisi a flusso laterale. Sebbene molte proteine possano essere dissolte in 1x PBS, alcune sono estremamente sensibili al pH, alla concentrazione di sale e alla presenza di uno stabilizzatore per il quale può essere chiamato trealosio. La rimozione della membrana è un altro passaggio importante che viene fornito con questo passaggio. In questa fase, la progettazione del test del saggio a flusso laterale consiste nel tracciare il test e controllare le linee anticorpali presenti sulla membrana di nitrocellulosa. Una considerazione importante in questo passaggio è della membrana di nitrocellulosa dove si dice che non mantenga la membrana di nitrocellulosa in un luogo dove non c'è umidità anzi è tutta secca. Per lo sviluppo del saggio a flusso laterale, la temperatura della membrana di nitrocellulosa dovrebbe essere umida. Poiché esistono diversi formati di analisi, ovvero formato competitivo e formato sandwich, anch'essi molto importanti. La concentrazione anticorpale differisce in entrambi i formati per il formato sandwich, la concentrazione anticorpale raccomandata è 1 mg/ml solo per gli anticorpi della linea di test e di controllo e questo limite può variare fino a 0.5-2 mg/ml. Nella fase della membrana di nitrocellulosa e nella guida allo sviluppo del flusso laterale, un'altra fase inclusa è la fase di blocco della membrana. Fare questo passaggio ha molti vantaggi come il flusso migliorato del fluido, la stabilità delle strisce reattive e il blocco del legame non specifico, quindi si ottengono i veri risultati. Per la maggior parte della membrana di nitrocellulosa nel saggio a flusso laterale, esiste una soluzione proprietaria che viene aggiunta al per rendere le membrane idrofile.
Il prossimo passo è il coniugato e il pad coniugato. Per lo sviluppo di un'analisi del flusso laterale è importante sviluppare parametri di coniugazione ottimizzanti. Quando un coniugato viene preparato per l'analisi a flusso laterale, viene dispensato e asciugato su un tampone di coniugato. Per sviluppare una coniugazione stabilizzata di anticorpi ci potrebbero essere diversi passaggi. I passaggi coinvolti nello sviluppo di un'efficacia coesa e migliorata della coniugazione. In questo passaggio, la stabilità di coniugazione è un passaggio molto importante e pertanto la stabilità colloidale deve essere ottimizzata durante la progettazione dell'LFA. la stabilità colloidale è molto essenziale per l'analisi del flusso laterale e quindi durante la progettazione e l'ottimizzazione dell'LFA questo è sempre tenuto in considerazione. Le nanoparticelle d'oro che svolgono un ruolo cruciale nella coniugazione in LFA hanno caratteristiche ottiche davvero uniche con l'aiuto delle quali assorbono e disperdono la luce con precisione ed efficacia. La forte interazione tra le nanoparticelle e la luce avviene a causa degli elettroni di conduzione presenti sulla superficie metallica che determinano l'oscillazione collettiva quando gli elettroni vengono eccitati dalla luce con la stessa ed uguale frequenza. Dopo una coniugazione riuscita si hanno degli effetti sulle caratteristiche ottiche in quanto si osserva la variazione dell'indice di rifrazione che può essere ulteriormente rintracciata negli spettri di UV-vis dalla distinzione della linea rossa. Anche per il trattamento del tampone di coniugazione potrebbero esserci diversi metodi. Alcuni di questi sono a immersione o a spruzzo uniforme con l'aiuto di un distributore automatico.
Successivamente, si verifica il processo di selezione del pad di esempio. Questa è la prima parte del flusso laterale test pertanto è essenziale controllare il materiale del tampone del campione e il pretrattamento del tampone del campione per verificarne il flusso e l'efficacia. I tamponi per campioni utilizzati per le analisi a flusso laterale sono di diverso tipo come fibre, cotone, sintetici, ecc. È stato inoltre osservato che alcuni campioni come urina, sangue, ecc. possono variare a causa di molti altri fattori che includono fattori biologici, tempi di alimentazione, bevanda prelevata prima della raccolta del campione sul dispositivo di analisi del flusso laterale e molti altri. Per trattare il tampone di campionamento e ottimizzarlo può essere utilizzato il tampone ottimizzato che presenta anche molti vantaggi. Durante lo sviluppo del saggio a flusso laterale e la selezione del tampone del campione, il tampone ootmizzato può aiutare a migliorare le prestazioni del saggio riducendo la variabilità del campione che include proteine, pH, viscosità, concentrazione di sale, ecc. Può anche migliorare il flusso e la consistenza del saggio durante lo sviluppo. I tamponi di trattamento si sono dimostrati estremamente utili nel mantenere il flusso e la consistenza, normalizzando il pH, agendo come agenti bloccanti mediante l'amalgamazione delle proteine, dei sali, dei tensioattivi con la giusta concentrazione di ciascuno. La specifica più importante del tampone per campioni da controllare è la capacità di assorbimento perché indica il volume del campione per un test.
Dopo aver selezionato il tampone di campionamento, viene successiva la selezione del tampone dello stoppino. Il tampone assorbente aiuta nel processo di adsorbimento dei reagenti che non sono stati assorbiti da nessuna delle due linee, ad esempio la linea di test e le linee di controllo. Il tampone di assorbimento arresta anche il flusso all'indietro del fluido utilizzato come campione. Si suggerisce che durante la selezione del materiale per il tampone di assorbimento, il materiale deve essere controllato per salvare il dispositivo da eventuali discrepanze che possono portare a problemi e forse a risultati falsi. Oltre al normale, il materiale spesso o il tampone traspirante non è migliore del materiale più sottile. Il materiale più sottile ha prestazioni migliori e di solito ha il materiale a capacità maggiore a volte. Ma ogni materiale deve essere controllato per le sue caratteristiche e la loro idoneità allo sviluppo del saggio di flusso laterale. Per selezionare la dimensione e il materiale del tampone di assorbimento è necessario mantenerlo allineato al fattore che la capacità di assorbimento deve essere maggiore e il volume del tampone deve essere in funzione.
Nel saggio a flusso laterale, l'assieme del test della striscia è anche la fase della sua guida allo sviluppo. Nell'assemblaggio di test su striscia, gli LFA sono assemblati sulla base di una produzione su larga scala o su piccola scala. Per alcuni tipi di analisi a flusso laterale, la lettura quantitativa potrebbe non essere un requisito, ma sarebbe richiesto il formato dell'asta di livello per eseguire il gruppo di test delle strisce in LFA. C'è una cassetta che ha una striscia di test all'interno è uno dei passaggi più essenziali e cruciali per ottenere il test che sia riproducibile e anche affidabile. Le due specifiche citate in precedenza sono estremamente significative soprattutto per i test quantitativi. Il compito principale della cassetta è fornire la pressione richiesta al fluido. Questo per garantire che ci sia il flusso ottimale e che anche il fluido passi attraverso l'assieme allo stesso flusso. La cassetta fa in modo che il liquido non resti sui bordi e scorra solo sulle pastiglie.
Dopo l'assemblaggio dello strip test, il passaggio successivo consiste nell'eseguire il test. Esistono diverse tecniche per eseguire l'analisi come l'analisi distrettuale nel coniugato liquido, analisi complete per il coniugato essiccato e il tampone di corsa. Per l'analisi della striscia, è necessario sapere se il test è qualitativo o quantitativo e deve essere scelto il metodo di analisi corretto. Per analizzare il test, può essere eseguito ad occhio nudo in cui ci sarebbero risultati sì/no o catturando un'impronta della linea di test, è possibile utilizzare uno scanner piano o una fotocamera con illuminazione controllata. L'ultimo passaggio è l'ottimizzazione del test in cui sono inclusi la scelta della coppia di anticorpi corretta, la membrana di nitrocellulosa, il tampone di stoppino, il tampone adsorbente e tutte le altre parti.
Conclusione:
Migliori guida allo sviluppo del Lateral Flow Assay è previsto da nove a dieci passaggi che devono essere seguiti accuratamente per creare un'analisi del flusso laterale.
Referenze
https://cdn.shopify.com/s/files/1/0257/8237/files/BioReady_Lateral_Flow_Handbook.pdf